四虎永久免费影院在线-四虎永久免费影院-四虎永久免费网站免费观看-四虎永久免费观看-国产精品麻豆综合在线-国产精品麻豆一区二区三区

在流式細胞檢測實驗中，除了血液樣本，幾乎所有的樣本均為實體組織，如脾臟、肝臟、腎臟、脂肪、腫瘤等，那么為了做好流式的檢測，我們首先得將實體組織消化成為活性較佳的單細胞懸液。

那么怎樣得到活性較佳的單細胞懸液呢？今天小晶為大家?guī)砜蛻糇稍兌嗟膶嶓w組織的單細胞懸液提取，以小鼠脾臟、小鼠腫瘤組織的提取為例，感興趣的話就跟小晶一起往下學(xué)習(xí)吧。

一、小鼠脾臟單細胞懸液制備

脾臟是體內(nèi)大的免疫器官，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心，負責(zé)機體的造血、紅細胞清除和免疫功能。一般免疫研究者很難逃過對脾臟的研究，如調(diào)節(jié)性T細胞、輔助性T細胞、巨噬細胞等的熱門研究，均有脾臟的身影，那么怎么獲得活性非常好的脾臟單個細胞呢？

詳情步驟：

① 獲取新鮮的小鼠脾臟，小鼠的脾臟呈橢圓形狀，可以直接用鑷子拉扯分離。將小鼠脾臟放入預(yù)冷的有適量 HBSS緩沖液的培養(yǎng)皿或大小適中的離心管中，并使用手術(shù)剪或眼科剪，小心將脾臟剪碎。

② 將細胞篩網(wǎng)放在50 mL 離心管上方，使用一次性移液器，將剪碎后的脾臟轉(zhuǎn)移到細胞篩網(wǎng)輕輕的搗碎或碾壓，使其通過篩網(wǎng)。必要時，加入5–10 mL PBS 沖洗。重復(fù)上述步驟，可使用1 mL注射器進行驗證，若通過篩網(wǎng)的細胞懸液使用注射器（帶針頭）進行反復(fù)吹打，則可認為單細胞懸液制備完成。

③ 將流式細胞懸液在4°C下，以400-600 g 或1500 rpm 離心細胞10 min，棄上清，用2–5 mL 預(yù)冷的1x PBS 重懸細胞。將重懸液置于冰上備用，必要時可以對細胞進行臺盼藍染色初步判斷活率，也可對細胞進行單細胞計數(shù)，調(diào)整至合適的細胞濃度后根據(jù)檢測實驗?zāi)康姆謩e進行染色、上機檢測。

二、小鼠腫瘤組織單細胞懸液制備

小鼠腫瘤發(fā)病特征和人類腫瘤很相似，因此對人類腫瘤的研究有很高的價值，而對應(yīng)的小鼠腫瘤動物模型的類型及其建立方法，對腫瘤研究起到至關(guān)重要的作用。進一步，如何更好地利用實驗材料驗證實驗結(jié)論，關(guān)鍵在于對腫瘤組織的檢測方法。其中流式檢測腫瘤組織的免疫功能就成了超級熱點，那么怎么才能得到活性較好的、干擾較少的腫瘤組織單細胞懸液用于流式檢測呢？跟小晶一起學(xué)習(xí)一下吧！

詳情步驟：

① 沿腫瘤組織輕輕剪開，盡可能完整的剝離整個腫瘤，將剝離好的腫瘤放入預(yù)冷的有適量 HBSS緩沖液的培養(yǎng)皿或大小適中的離心管中，盡量冰上放置保持細胞良好活性。

② 并使用手術(shù)剪或眼科剪，小幅度、高頻的方式將腫瘤塊剪碎，大約剪成＜1mm2大小（肉眼看呈泥漿狀），整個過程建議在冰上操作，使用適量的 PBS 進行洗滌，1500 rpm 離心10 min，沉淀的組織樣本待消化。

③ 每樣本加入2-3 mL 配置好的消化液（可根據(jù)腫瘤大小調(diào)整1×消化液的用量），用1 mL 槍頭將腫瘤組織碎末打散，置于37 °C 恒溫搖床，300 rpm 搖晃，使酶與組織充分接觸，約消化30 min 左右，期間每15 min 取出吹打一次，可取一滴觀察細胞分離情況，從而適當調(diào)整消化分離時間，消化時間不宜過長，以免影響免疫細胞活性。

④ 消化完畢后，加入3 mL（組織量過多可成倍加入含5%血清的 DMEM 終止消化。用巴氏吸管吸取消化后的腫瘤組織懸液至70 μm 細胞濾網(wǎng)過濾，同時用1 mL 注射器后部研磨遺留在濾網(wǎng)上的組織塊，所得懸液4 °C，50 g 離心10 min，收集上清，則為腫瘤細胞懸液。

⑤ 根據(jù)所購買的淋巴流式細胞分離液，對腫瘤懸液進行 PBMC 的提取，提取出中間白膜層后根據(jù)檢測的實驗?zāi)康姆謩e進行染色、上機檢測。